元治元年（1864）
4月22日
新選組於松原通東木屋町的火災現場逮捕一可疑人物，訊問之下，可疑人物招供自己本應是八月十八日政變被逐出的長州藩士，但和其他藩士、浪士等約250人，偷偷潛伏在京都。
5月3日
近藤上書會津藩，表明新選組是為了攘夷而集結，並向幕府請示新選組今後的去向。
5月7日
將軍德川家茂即將返回江戶，新選組同行護衛至大坂。
5月16日
德川家茂自大坂啟程返回江戶。
5月20日
新選組於天神橋暗殺大坂西町奉行所的與力內山彥次郎。
內山暗殺事件是史實，但究竟是不是新選組所為目前仍有爭議。
主張是新選組所為的學說推測暗殺原因有二，一是文久三年新選組在大坂與力士起衝突後，與力的內山在調查事件時態度高壓，與近藤結下樑子；二是內山與倒幕派志士聯手，於大坂惡意操作米價，搞得人民怨聲載道，新選組暗中調查後決定暗殺內山。
6月5日
一早，武田觀柳齋率幾名隊士，逮捕了桝屋喜右衛門（本名古高俊太郎）。
嚴刑逼供下，古高招供以長州為首的倒幕派勢力正計畫於京都放火，並趁亂綁架天皇。新選組將此事呈報會津藩，會津藩下令當天晚上於祇園會所前集合，搜查倒幕派志士聚集的地點。
當晚發生的正是讓新選組一舉名震天下的池田屋事件。
6月10日
於東山的料亭誤殺土佐藩士。
7月19日
禁門之變，與長州軍開始正面衝突。
7月21日
新選組與其他幕府勢力於山崎天王山攻打長州軍。
7月23日
朝廷下勅許（天皇的許可文書），同意幕府征伐長州。
9月5日
近藤、永倉、武田、尾形自京都啟程，僅花五天便於9月10日抵達江戶。
（浪士組從江戶出發到京都花了15天，下述近藤與伊東等人從江戶回到京都花了11天，可以看出這邊只花五天就從京都走回江戶有多猛。）
10月15日
伊東甲子太郎一行自江戶出發，前往京都。
10月16日
伊東一行與近藤等人會合，一同前往京都。
10月27日
近藤、伊東等人抵達京都。
11月
新選組以所有隊士共67人編寫行軍錄，並頒布「軍中法度」，即軍隊內的守則。
行軍錄將所有人分為一～八小隊，再加上一個運輸小隊，共九個小隊。日後雖偶有變動，但這個分隊方式原則上一直維持到慶應三年（1867）為止。
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